Tecnologia da Biologia Celular e Molecular

Tecnologia da Biologia 

Celular e Molecular



Os conhecimentos sobre as células progridem

paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de

investigação. O aparecimento de numerosas técnicas de

uso comum e os diversos ramos da pesquisa biológica

levaram ao surgimento do que se costuma chamar de

biologia celular e molecular, que é o estudo integrado das

células, através de todo o arsenal técnico disponível.

Neste material serão incluídos apenas algumas técnicas

que têm contribuído para o progresso da biologia celular

e molecular.



O MICROSCÓPIO ÓPTICO OU 

MICROSCÓPIO DE LUZ

Limite de resolução e poder de resolução

Limite de resolução: é a menor distância

entre dois pontos que permite distinguí-los

separadamente.

Poder de resolução: é a capacidade de

fornecer imagens nítidas. Quanto menor o LR

melhor poder de resolução.



Fórmula para o cálculo do LR

LR = K/AN

AN = n.sen 

LR = limite de resolução

K = constante experimental

estimada em 0,61

 = comprimento de onda da

radiação

n = índice de refração do meio

 = ângulo formado pelo eixo

óptico da lente objetiva e o

raio de luz mais externo

utilizado na formação da

imagem.

Comprimento de onda da luz varia de 400 – 700 nm.

Comprimento de onda do elétron é de 0,005 nm.



Dica:

relação entre as unidades apresentadas abaixo:

1 mm = 1000 m (micrômetro); 1 m = 1000 nm

(nanômetro); 1 nm = 10 A (angstrom)

Olho humano 0,2 mm

Microscópio de luz 200 nm (0,2 m)

MEV 10 A (1 nm)

MET Ao redor de 1 – 2 A (0,1 – 0,2 nm).

Aspectos comparativos do LR



TIPOS DE MICROSCOPIA

MICROSCOPIA ÓPTICA (MO):

• Campo claro;

• Campo escuro;

• Contraste de fase;

• Contraste interferencial;

• Polarização;

• Fluorescência;

• Microscópio invertido;

• Microscópio estereoscópico;

• Confocal a laser.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA (ME):

• de varredura (MEV)

• de transmissão (MET)



MEV

MET

MO









Formação de imagens ao MO
A imagem final será

virtual, maior e

invertida em relação

ao objeto.



LENTES NO MO



LENTES NO MET



Processamento: MO MET MEV

Dimensão/corte Variável 1mm Variável

Fixação Aldeídos, 

Bouin

Aldeídos Aldeídos 

Pós-fixação OsO4 OsO4
Desidratação Álcool, 

acetona. 

Álcool, 

acetona.

Álcool, 

acetona.

Inclusão Parafina ou

Historesina

Epon, Spur 

ou Araldite

Secagem

Microtomia Micrótomo Ultra-

microtomo

Contrastação Coloração Pb, Uranila e 

etc

Evaporação 

com ouro



Etapas da 

preparação 

das amostras 

para MO. 



Etapas da 

preparação 

das amostras 

para a MET



- Navalhas
Aço
Vidro (1950)
Diamante e safira (1959)

PREPARO DAS NAVALHAS DE VIDRO

MICROTOMIA





NAVALHA DE DIAMANTE

3000 US$





Técnica de contrastação (Dupla contrastação)

Acetado de uranila

Citrato de chumbo

Solução a 2%

de 3 a 10 min.

e lavar 3

vezes em água

destilada.

Solução a 3% com

mesmo processo

anterior.



Somente Pb Uranila + Pb

Fígado de camundongo



Imagens ao MET



Raiz (glutaraldeído seguido por

tetróxido de ósmio).

Pâncreas de rato (glutaraldeído

(2,5%), cacodilato (0,1M),

acetato de uranila/citrato de

chumbo.

Célula de camundongo em 

apoptose mediada por LTC



MEV - UNICAMP 

Imagens ao MEV

CITOQUÍMICA

Citoquímica: compreende técnicas diversas para a identificação e

localização das moléculas que constituem as células

Ácido desoxirribonucléico (DNA): O DNA é demonstrado

citoquimicamente pela reação de Feulgen. Etapas:

• Mergulha-se as lâminas em solução aquecida de ácido clorídrico, o

que promove hidrólise das bases púricas, deixando livre as

extremidades da desoxirribose, que possuem radicais aldeídos;

• Trata-se o preparado pelo reativo de Schiff (solução de fucsina

básica descorada pelo anidrido sulfuroso), que, ao se combinar com

os grupamentos aldeídicos da desoxirribose, forma um complexo de

cor vermelha.





Polissacarídeos: um exemplo é a técnica para evidenciar o glicogênio

conhecida como técnica do PAS (periodic acid Schiff).

• A reação baseia-se na oxidação pelo ácido periódico, de

grupamentos OH vizinhos, formando grupamentos aldeídicos que dão

cor vermelha ao reativo de Schiff.

• A reação não é específica para glicogênio, de modo que se aplica um

artifício: tomam-se duas lâminas com cortes do mesmo tecido, uma

das quais é previamente tratada pela enzima alfa-amilase. Essa enzima

hidrolisa e remove o glicogênio. Portanto, a estrutura que aparecer

corada pelo PAS na lâmina não tratada pela alfa-amilase mas não

aparecer corada na lâmina tratada pela enzima é glicogênio.






A microscopia de fluorescência é geralmente aplicada com técnicas

citoquímicas

• A principal aplicação da microscopia de fluorescência ocorre em

combinação com métodos imunológicos, nas técnicas

imunocitoquímicas que utilizam anticorpos conjugados a compostos

fluorescentes.

• A imunocitoquímica se baseia na reação antígeno-anticorpo, esta

técnica pode ser realizada aplicando-se a imunocitoquímica direta

(pouco sensível, e por isso, pouco usada atualmente) ou a

imunocitoquímica indireta (maior sensibilidade, permitindo a

demonstração de quantidades mínimas de antígeno, sendo a mais

usada na prática).

• Algumas substâncias podem ser utilizadas para marcar os

anticorpos, dentre elas: peroxidase, ferritina, anticorpo fluorescente,

complexo de ouro coloidal + proteína A (extraída das bactérias

Staphylococcus aureus).



Fonte de luz

Filtro de luz

Espelho difusor 

do feixe

Lente 

objetiva

Objeto

Filtro emissor



Técnica imunocitoquímica direta: O composto (precipitado) formado pela ação da

peroxidase sobre a 3-3’-diaminobenzidina é de cor marrom-clara e elétron-denso.

Por isso, a técnica pode ser aplicada tanto à microscopia óptica como à eletrônica.

Imunocitoquímica direta com anticorpo

fluorescente



Etapas da imunocitoquímica indireta: Na etapa 1, o antígeno cuja localização se

deseja determinar combina-se com o anticorpo específico, formando um complexo

que não é visível nem no microscópio óptico, nem no eletrônico. A finalidade das

etapas seguintes é tornar esse complexo visível. Na etapa 2, agrega-se

antigamaglobulina marcada com peroxidase ao complexo já formado. Na etapa 3,

por meio da técnica citoquímica para peroxidase, forma-se precipitado visível nos

microscópios óptico e eletrônico, revelando-se assim o local onde está presente o

antígeno cuja localização era desejada.



Esquema para demonstrar a maior sensibilidade da imunocitoquímica

indireta. Pela técnica direta, esse antígeno celular fixaria quatro

moléculas do anticorpo; pela técnica indireta, ele fixou 20 moléculas

de antigamaglobulina.



Esfregaço da bactéria Klebsiella pneumoniae vista ao microscópio de fluorescência.
https://www.passeidireto.com/arquivo/5782343/tecnologia-da-biologia-celular